Polymorphisme de restriction (RFLP)

[Batbat]

Salut,

Je n'ai pas très bien compris la technique du Southern Blot permettant de détecter un polymorphisme de restriction, la prof explique rapidement ...

Merci d'avance !!!!

[Mverdun]

Salut BatBat !

Je vais te réexpliquer le principe du Southern blot , technique utilisant le principe de digestion de l'ADN par une enzyme de restriction ainsi qu'une électrophorèse.

La technique du Southern blot a été mise au point en 1975. Elle permet d'identifier des polymorphismes de longueur de restriction (RFLP) qui correspondent à des variations de quelques nucléotides créant ou abolissant un site de restriction enzymatique.

Cette technique comporte plusieurs étapes.

Tout d'abord on part du principe qu'on dispose d'une séquence d'ADN dans sa globalité.
Notre but est d'identifier un fragment du génome particulier sur la séquence dont on dispose grâce à l'utilisation d'une sonde radioactive complémentaire à la séquence que l'on veut identifier.

Dans un premier temps, on va digérer la séquence d'ADN dans un tube à essai grâce à l'utilisation de plusieurs enzymes de restriction qui ne vont pas couper l'ADN au même endroit.
On obtient donc un tube avec plusieurs fragments de la séquence de base.
Par le suite, on utilise une sonde radioactive qui est complémentaire de la séquence que l'on veut identifier ce qui va permettre de la mettre en évidence à l'électrophorèse.

Dans un second temps, on utilise le principe d'électrophorèse. On dépose le contenu du tube à essai sur le gel d'électrophorèse pour séparer les différents fragments. En effet, plus une séquence génomique est "lourde" en terme de nucléotides moins elle va migrer ce qui va permettre de séparer les différents fragments car ils ne contiennent pas la même séquence nucléotidique.


Dans son cours, Madame Winter prend l'exemple d'une mutation qui fait apparaître un site de restriction enzymatique.
Ce site de restriction enzymatique peut être détecté grâce à la technique du Southern Blot en utilisant les différentes étapes que je t'ai décrit précédemment.
En effet, on digère notre fragment d’ADN par l’enzyme Pst1 puis on hybride une sonde au niveau du site qui est apparu ou qui a été aboli.
o Si le site existe, on aura un fragment digéré de 3kb (petit fragment) car l'enzyme l'a coupé
o S‘il n’existe pas, le fragment sera plus long et il aura une taille de 4 kb car l'enzyme ne l'a pas coupé

J'espère avoir répondu à ta question, si tu en as d'autres , n'hésites pas !

Toute l'équipe de BDR-Genet-Physio te souhaite bon courage <3

[Batbat]

j'ai tout compris, super ! merci bcpppp !!!